用于檢測未知抗體的間接法
更新時間：2012-06-04 | 點擊率：4318
用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，
4℃過夜。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,
置37℃孵育1小時，洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照） 于反
應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育
30-60分鐘，洗滌,后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
操作要點：
1 標(biāo)本的準(zhǔn)備
可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾
液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體
或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定（如血清、尿液），有些
則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）
2 試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾
水或去離子水，包括用于洗滌的鹽，應(yīng)為新鮮和高品質(zhì)的。自配的
緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與
室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱
保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。
加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并
注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)
更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。有時測定（如間接法ELISA）需用稀
釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔
中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩
1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合液和底物反應(yīng)液時可用定量多道加液
器，使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。
抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為
溫育。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。
以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是
都有均等的和固相抗體結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中
的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散
才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合
也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃
是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫
度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原
抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達。為加速反
應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的
溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在
冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中
一般不予采用。
保溫的方式除某些ELISA儀附有特制的電熱塊外，一般均采用水
浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度
迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮
膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA
板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底
墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱
中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是
水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅
速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍
內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要
求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)
注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成
敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目
的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物
質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚
苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種
非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌
是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按
要求洗滌，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作
一般用浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將
洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置
1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。
吸干應(yīng)*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾
或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在
間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。
6 顯色和比色
（1） 顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成
有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間
內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適
當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反
應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行，
時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的
顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再
延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，
顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD
產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)邊觀
察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)
果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，
至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和
十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚
能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止
劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定
的波長（450nm）測讀吸光值。
（2） 比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放
入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標(biāo)
準(zhǔn)96孔的座架中，才可進行比色。好在加底物液顯色前，先將軟
板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液
的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記
錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各
孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。
比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用
吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸
收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方
法為"A492nm"或"OD492nm"。
（3） 酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光
度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試
管的設(shè)計。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指
標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、度和可測范圍、
線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001，準(zhǔn)確性為±
1%，重復(fù)性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔
相對于空氣的真實A值應(yīng)為1.083±0.01（1.073~1.093），重復(fù)測定
數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標(biāo)儀的可
測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000，
新型號的酶標(biāo)儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A
值常以"*"或"over"或其它符號表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的
不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為
0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制
作標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)予注意。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操
作時室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果
更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm
波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*
次在適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動
ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，終測
得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃
痕或指印等造成的光干擾。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳
細閱讀說明書。
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