干貨分享—常用的細胞凋亡檢測方法匯總(一)
干貨分享
常用的細胞凋亡檢測方法匯總(一)
讓我們一起學習一下吧~
細胞凋亡是一個進程，該期間凋亡相關(guān)通路被激活，各種分子參與調(diào)控，出現(xiàn)一系列的凋亡特征。例如細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外；又例如當細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)相較正常細胞而言會固縮。因此，通過檢測相應(yīng)的指標可鑒定凋亡水平。
本文分享了常見的幾種細胞凋亡檢測方法，讓我們一起學習一下吧~
形態(tài)學檢測
發(fā)生凋亡的細胞在形態(tài)上有一定的特征：相較正常細胞而言，凋亡細胞體積變小，凋亡Ⅰ期的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；凋亡晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。在透射電子顯微鏡下可看到凋亡細胞體積變小，表面微絨毛消失，細胞質(zhì)濃縮。使用核染料（Hoechst系列、DAPI）染色后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下可看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或細胞核裂解成碎塊狀呈致密濃染。
膜通透性改變
細胞發(fā)生凋亡時，細胞膜通透性會逐漸降低。Hoechst系列可以穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。膜不可滲透性染料（例如：Propidium Iodide/PI）不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，膜不可滲透性染料染料可以染色壞死細胞。根據(jù)此特性，使用Hoechst系列和PI染料雙染后，使用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測時，正常細胞為弱紅色熒光＋弱藍色熒光，凋亡細胞為弱紅色熒光＋強藍色熒光，壞死細胞為強紅色熒光＋強藍色熒光。
磷脂酰絲氨酸（PS）
翻轉(zhuǎn)到細胞膜外
細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。
Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。7-AAD是一種非滲透性的核酸熒光染料，該染料不能透過活細胞的細胞膜，但可穿透膜損傷細胞如晚期凋亡細胞或者壞死細胞的細胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，可用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。因此，可以采用AnnexinV與7-AAD雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。
